Микротехника для зоологов

ПРОГРАММА КУРСА

Составитель: д.б.н., профессор Темерева Елена Николаевна

Планируемые результаты обучения по дисциплине (модулю):

Знать: принципы работы по стандартному гистологическому протоколу

Уметь: проводить пробоподготовку по стандартному протоколу

Владеть: знаниями об особенностях гистологического строения тканей и органов беспозвоночных

Иметь опыт самостоятельного приготовления стандартных гистологических красителей; иметь опыт работы на микротомах различной конструкции и анализа срезов при помощи световых микроскопов

Место и время проведения: кафедра зоологии беспозвоночных МГУ, аудитория 599-Б; весенний (VI) семестр 3 курса.

Введение

История создания светооптических систем. Основные законы оптики, использующиеся в световых микроскопах. Устройство светового микроскопа и отдельных его частей. Строение конденсора, объективов и окуляров. Маркировка объективов и окуляров. Предмет гистологии. История появления и развития гистологии. Разработка методов окрашивания. Современная гистология как наука, сочетающая целый спектр методов: от прижизненной световой фото- и видеомикроскопии до конфокальной лазерной сканирующей микроскопии высокого разрешения. Что такое цифровая гистология. Место гистологии в современной науке.

Тема 1. Основные этапы стандартного гистологического протокола; типы гистологических препаратов

Сбор, предварительное расслабление и фиксация материала. Отмывка от фиксатора и хранение. Обезвоживание, пропитка и заливка. Микротомирование: подготовка стекол, толщина срезов, положение срезов на стекле. Депарафинизация и окраска. Основные гистологические красители. Многоступенчатая гистохимическая окраска: плюсы и минусы. Дегидратация препаратов и заключение в канадский бальзам. Этикетка. Типы гистологический препаратов: временные и постоянные; тотальные препараты, гистологические срезы замороженных тканей, парафиновые срезы.

Тема 2. Префиксация, фиксация и хранение материала; изготовление постоянных тотальных препаратов

Что такое префиксация, зачем и в каких случаях она нужна. Типы фиксаторов: плюсы и минусы основных гистологических фиксаторных растворов и их правильное приготовление. Соленость и осмомолярность – как их учесть при фиксации материала. Буферные растворы и их приготовление. Как правильно хранить материал, основные презервационные растворы. Что такое тотальные препараты. Основные принципы окраски и заключения целых объектов. Типы сред для заключения тотальных препаратов: недостатки и преимущества.

Тема 3. Парафиновая гистология; дегидратация и заливка, заливочные среды

Декальцинация – предварительный этап для удаления твердых структур. Использование плавиковой кислоты для растворения скелетных элементов из оксида кремния. Основные типы заливочных сред и области их применения. Основные принципы дегидратации и пропитки. Протоколы пропитки материала с использование абсолютного спирта или бутилового спирта. Протокол пропитки материала без использования ксилола. Приготовление и использование смеси ксилола и парафина («каша»): недостатки и преимущества. Особенности протокола пропитки и заливки в зависимости от особенностей строения объекта. Заливочные среды: парафин, парапласт, целлоидин. Основные физические характеристики заливочных сред.

Тема 4. Строение микротомов различных типов, микротомирование

Ротационный микротом: устройство и принцип работы. Салазочный микротом: устройство и принцип работы. Современные микротомы: особенности строения и принцип работы. Положение препарата при микротомировании. Положение ножа при микротомировании. Толщина срезов. Непрерывная серия срезов. Способы решения стандартных проблем при микротомировании. Подготовка стекол для срезов. Положение срезов на стеклах.

Тема 5. Основы гистохимии; гистохимические красители; изготовление постоянных препаратов парафиновых срезов

Гистохимия, раздел гистологии, изучающий локализацию различных химических веществ и продуктов их метаболизма в тканях. Современная иммуногистохимия и ее значение для науки и общества. Основные принципы гистохимической окраски. Базофильные, ацидофильные и нейтрофильные структуры клетки. Особые аргирофильные структуры. Нуклеофильные красители. Протоколы использования красителей для выявления мукополисахаридов, соединительной ткани, микрофолоры, ферментов. Гематоксилины. Протокол приготовления гематоксилина Карачии. Депарафинизация и окраска срезов. Заключение срезов. Типы сред для заключения постоянных препаратов:

Тема 6. Типы тканей; анализ и описание тканей и органов беспозвоночных

Основные типы тканей беспозвоночных животных: эпителиальная, соединительная (в том числе кровь, хрящ, жир), нервная, мышечная. Гистологические особенности строения клеток тканей разных типов. Как на гистологических срезах определить тип ткани. Правильные описательные характеристики каждого типа тканей.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

Дегидратация материала, пропитка, заливка, микротомирование, монтировка срезов на стекла, окрашивание по двум протоколам (гематоксилин Караччи + спиртовой раствор эозина; азокармин по Гейденгайну), заключение препаратов в среду, этикетирование. Оцифровка срезов, подготовка описаний гистологического строения тканей и органов. Зачет.

Вопросы для теоретического контроля:

1. Основные этапы протокола изготовления гистологических срезов
2. Типы гистологических препаратов. Что такое тотальный препарат и основные шаги его приготовления.
3. Типы микротомов, их устройство и принцип работы
4. Основные принципы работы гистохимических красителей: примеры красителей, их состав, воздействие на ткани и результат окрашивания
5. Приведите примеры красителей для парафиновых гистологических срезов и опишите принцип их действия на ткани
6. Основные типы тканей. Опишите типы тканей на полученных вами срезах
7. Что такое иммуногистохимия и ее значение для человека
8. Использование буферных растворов в микротехнике.
9. История развития микроскопии
10. Гематоксилины: назовите некоторые конкретные красители и принцип их действия на ткани
11. Основные принципы пропитки и заливки материала, разнообразие и особенности заличвочных сред.
12. Микротомирование: типы микротомных ножей и особенности их использования, угол наклона ножа и его значение для микротомирования, нанесение серий срезов на стекла, подготовка стекол для нанесения срезов
13. Что такое префиксация, фиксация и консервация материала? Назовите основные фиксаторные жидкости, для каких целей использую те или иные фиксаторы
14. Устройство светового микроскопа, типы объективов, маркировка на объективе

РАСПИСАНИЕ и ПЛАН РАБОТЫ

по курсу «Микротехника» на весенний семестр 2021 года

(план может быть скорректирован)

Теоретические вопросы к зачету:

1. Основные этапы протокола изготовления гистологических срезов
2. Типы гистологических препаратов. Что такое тотальный препарат и основные шаги его приготовления.
3. Типы микротомов, их устройство и принцип работы
4. Основные принципы работы гистохимических красителей: примеры красителей, их состав, воздействие на ткани и результат окрашивания
5. Приведите примеры красителей для парафиновых гистологических срезов и опишите принцип их действия на ткани
6. Основные типы тканей. Опишите типы тканей на полученных вами срезах
7. Что такое иммуногистохимия и ее значение для человека
8. Использование буферных растворов в микротехнике.
9. История развития микроскопии
10. Гематоксилины: назовите некоторые конкретные красители и принцип их действия на ткани
11. Основные принципы пропитки и заливки материала, разнообразие и особенности заличвочных сред.
12. Микротомирование: типы микротомных ножей и особенности их использования, угол наклона ножа и его значение для микротомирования, нанесение серий срезов на стекла, подготовка стекол для нанесения срезов
13. Что такое префиксация, фиксация и консервация материала? Назовите основные фиксаторные жидкости, для каких целей использую те или иные фиксаторы
14. Устройство светового микроскопа, типы объективов, маркировка на объективе