Электронная микроскопия для зоологов

ПРОГРАММА КУРСА: "Современные методы электронно-микроскопических исследований в зоологии беспозвоночных"
Составитель: д.б.н. Наталья Михайловна Бисерова

Цель курса: дать студентам теоретические основы и практические навыки научных исследований методами электронной и конфокальной микроскопии.

Задачи курса: получить представление об устройстве электронных (просвечивающие, сканирующие), световых флуоресцентных и лазерных конфокальных микроскопов;
освоить современные способы подготовки материала для различных методов микроскопии;
получить практические навыки в подготовке материала и самостоятельной работе на основных типах микроскопов.

Место и время проведения: кафедра зоологии беспозвоночных, ЦКП электронной микроскопии, ЦКП конфокальной микроскопии; осенний (V) семестр 3 курса.

Краткое содержание курса: Курс представляет собой цикл лекций и практические занятия, в которых даны теория и практика электронно-микроскопических исследований для биологов. В лекциях даны общие сведения о принципах устройства и работы электронных микроскопов, их возможностях и перспективах использования. Рассмотрены теоретические основы методов подготовки водных животных для изучения ультраструктуры с применением трансмиссионного и сканирующего микроскопов. Даются основы знаний, необходимых для приготовления фиксирующих растворов, современные методы фиксации, пропитывания и заключения в смолы определённых, заданных параметров. На практических занятиях слушатели знакомятся с устройством ультрамикротомов, получают практические навыки по изготовлению полутонких и ультратонких срезов, знакомятся с принципами контрастирования мембран для изучения в потоке электронов, а также с методами окраски срезов.
В курсе даны основы знаний и практические навыки по исследованию ультраструктуры поверхности водных биологических объектов, освещены особенности методов подготовки зоологического материала для исследования в сканирующем электронном микроскопе. Рассмотрены современные методы анализа изображений, появления артефактов, связанных с разными методическими погрешностями.
Самостоятельный раздел курса посвящён устройству и принципу работы конфокального микроскопа. Подробно рассматриваются методы подготовки биологического материала для изучения под конфокальным микроскопом, методы визуализации наноструктур. Даются основы иммуноцитохимии для зоологов, навыки работы с антителами. Практическая часть включает занятия на конфокальном микроскопе и методы обработки полученных результатов, 3D-реконструкцию, сохранение данных в разных форматах.
Преподаются основы техники безопасности при работе с фиксирующими жидкостями и электронно-микроскопической техникой.

Студенты, завершившие изучение данной дисциплины, должны:

    знать теоретические основы электронной и конфокальной микроскопии;
    познакомиться с различными типами электронных микроскопов;
    иметь представление об устройстве электронных (просвечивающие, сканирующие), световых флуоресцентных и лазерных конфокальных микроскопов;
    знать современные способы подготовки материала для различных методов микроскопии;
    иметь практические навыки подготовки материала для различных методов микроскопии;
    иметь практические навыки работы на основных типах микроскопов;
    знать основы техники безопасности при работе в химической лаборатории с фиксирующими жидкостями и электронно-микроскопической техникой.

Разделы:

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Тема 1:
Общие сведения об истории создания, принципах устройства и работы просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов (ТЭМ). Вакуумная система, электронные линзы, разрешение в ТЭМ. Астигматизм и особенности фокусировки. Новые возможности и перспективы использования в биологии.
Тема 2:
История создания и принцип работы сканирующего (растрового) электронного микроскопа (СЭМ). Разрешение и получение изображения. Астигматизм и особенности фокусировки в растровом микроскопе. Возможности и перспективы использования в биологии.
Тема 3:
Методы подготовки водных животных для изучения ультраструктуры с применением ТЭМ. Особенности биологических объектов. Понятие фиксации живого объекта. Нормы международного кодекса работы с животными. Общие принципы предфиксационной подготовки животных.
Тема 4:
Основы техники безопасности при работе с фиксирующими жидкостями, растворителями, ЛВЖ, летучими и токсичными веществами; безопасность при работе с электронно-микроскопической техникой.
Тема 5:
Основы знаний для приготовления буферных смесей и фиксирующих растворов, современные методы фиксации.  Фиксация: цель фиксации, размеры кусочков, способы взятия ткани для фиксации. Способы фиксации: перфузия, прижизненная, биопсия. Основные параметры фиксации: выбор фиксирующих растворов, температуры, времени, необходимость использования буферных смесей, физиологических значений pH и осмомолярности.
Тема 6:
Свойства фиксаторов. Образование поперечных связей между молекулами, возникновение прочной сети связей. Особенности воздействия фиксаторов на разные группы молекул. Альдегидные фиксаторы. Четырехокись осмия. Другие фиксаторы для электронной микроскопии.
Тема 7:
Маточные растворы и разведение. Понятие молярности раствора. Концентрация раствора. Понятие осмотического давления. Расчет осмомолярности раствора. Приготовление буферных смесей и фиксаторов заданной осмомолярности.
Тема 8:
Основные принципы подготовки фиксированных объектов для исследования в высоковакуумной системе трансмиссионного электронного микроскопа. Способы дегидратации, переходные жидкости. Эпоксидные смолы, основные свойства различных смол, цель использования, условия пропитывания ткани и полимеризации.
Тема 9:
Основы знаний для исследования ультраструктуры поверхности водных биологических объектов; особенности методов подготовки зоологического материала для исследования в СЭМ. Предфиксационная подготовка; методы очистки поверхности объекта; фиксация; дегидратация. Понятия раздела сред и давления поверхностного натяжения. Знакомство с методом высушивания в критической точке. Принцип работы установки, свойства переходных жидкостей.
Тема 10:
Формирование изображения в СЭМ. Понятие электропроводности объекта. Напыление (или покрытие) объекта разными электропроводящими металлами и углеродом. Тлеющий разряд. Преимущества ионного напыления в тлеющем разряде. Способы монтировки объектов для придания электропроводности.
Тема 11:
Принципы работы ультрамикротомов; условия, необходимые для  корректной работы прибора. Тримминг, полезные свойства пирамиды. Найфмейкер – прибор для изготовления стеклянных ножей; особенности стеклянной режущей поверхности. Принципы изготовления полутонких и ультратонких срезов. Методы монтировки срезов. Методы контрастирования мембран для изучения в потоке электронов. Химические свойства контрастёров, основы знаний для работы с радиактивными веществами и солями тяжёлых металлов.
Тема 12:
Анализ изображений, полученных при работе на ТЭМ или СЭМ. Понятие артефакта. Виды артефактов. Условия появления артефактов, связанных с разными методическими погрешностями.
Тема 13:
Устройство и принцип работы конфокального микроскопа. Методы подготовки зоологического материала для изучения под конфокальным микроскопом; методы визуализации наноструктур. Понятие флуоресценции. Основные свойства флуорофоров. Спектральный диапазон; спектр поглощения или возбуждения (Excitation), спектр испускания (Emission). Автофлуоресценция.
Тема 14:
Основы иммуноцитохимии для зоологов. Основные методы окраски антигенов. Прямые методы. Непрямые (сэндвич) методы. Гистохимические красители в конфокальной микроскопии. Теоретические основы подготовки биологического объекта для проведения иммуноцитохимической реакции. Способы фиксации, заморозки. Преинкубация: цели, задачи и методы этапа. Подготовка инкубационных растворов, разведение антител, способы хранения. Первичные и вторичные антитела: цели, задачи и методы этапа. Изготовление препаратов: среды для заключения, способы хранения.

ПРАКТИКУМ
Практическое занятие 1:
Знакомство с лабораторным оборудованием, правила поведения и работы в лаборатории микротомии; организация графика дежурств, подготовка лабораторной посуды и необходимого инвентаря. Инструкция по технике безопасности.
Практическое занятие 2:
Приготовление натрий-натриевого фосфатного буфера с заданным значением pH. Знакомство с работой на электронных весах, pH-метре. Особенности подготовки посуды для хранения маточных растворов.
Практическое занятие 3:
Приготовление натрий-какодилатного буфера с заданным значением pH. Знакомство с мерами предосторожности и техникой безопасности при работе с фиксаторами. Приготовление фиксатора 2,5%-ного глутарового альдегида. Самостоятельная фиксация объектов, 1 этап.
Практическое занятие 4:
Приготовление осмиевого фиксатора: подготовка посуды для фиксатора, приготовление маточного раствора четырехокиси осмия, приготовление фиксатора четырехокиси осмия необходимой концентрации. Фиксация объектов методом двойной глутар-осмиевой фиксации.
Практическое занятие 5:
Навыки работы с высокополимерными смолами. Расчёт необходимого количества готовой смолы и расчёт смешиваемых компонентов для приготовления эпоксидных смол (эпон, аралдит) заданных параметров. Дегидратация и начальный этап пропитки фиксированных объектов для ТЭМ.
Практическое занятие 6:
Самостоятельная работа с объектами. Подготовка материала для изучения на ТЭМ (дегидратация объектов, поэтапная пропитка смолой, полимеризация).
Практическое занятие 7:
Подготовка материала для изучения на СЭМ (дегидратация, высушивание объектов в установке критической точки, самостоятельная монтировка объектов на столики, ионное напыление).
Практическое занятие 8:
Знакомство со СЭМ, самостоятельное изучение подготовленных на занятиях образцов, анализ изображения, анализ артефактов, правила хранения данных.
Практическое занятие 9:
Подготовка материала для изучения на ТЭМ. Тримминг – подготовка блоков для резки, или как сделать пирамидку. Приготовление красителей для полутонких срезов, 1%-ный раствор метиленовой сини для окраски эпоксидных срезов.
Практическое занятие 10:
Изготовление стеклянных ножей, анализ режущей поверхности. Обучение работе на ультрамикротомах УМТП3, LKBIII; изготовление полутонких срезов. Самостоятельная работа с объектами.
Практическое занятие 11:
Приготовление контрастёров для ультратонких срезов: 4%-ного водного уранилацетата; 4%-ного водного цитрата свинца. Приготовление раствора формвара и изготовление плёночных подложек для ультратонких срезов.
Практическое занятие 12:
Обучение и самостоятельное изготовление ультратонких срезов на ультрамикротоме. Монтировка срезов на сетки и бленды с подложками. Контрастирование срезов. Самостоятельная работа с объектами.
Практическое занятие 13:
Знакомство с просвечивающим электронным микроскопом, самостоятельное изучение подготовленных на занятиях срезов, анализ изображения, анализ артефактов, правила хранения негативов и файлов.
Практическое занятие 14:
Приготовление фиксатора для иммуноцитохимических исследований. Фиксация материала для работы на конфокальном микроскопе. Основные этапы подготовки ткани для проникновения антител, подготовка растворов для преинкубации. Преинкубация. Подготовка растворов первичных антител. Инкубирование объектов; основы знаний о первичных и вторичных антителах, навыки работы с флуорофрами. Конъюгирование с вторичными антителами. Заключение препарата в среду с заданными светопреломляющими параметрами.
Практическое занятие 15:
Знакомство с конфокальным микроскопом, просмотр препарата в режимах флуоресцентной  лампы  и  при сканировании лазерами; захват изображения по оси x/y; x/z; z/y. Практическое занятие на конфокальном микроскопе. Методы обработки полученных результатов, 3D-реконструкция, сохранение данных в разных форматах.

Форма аттестации по итогам курса: зачёт.

Примерный список вопросов к зачёту:

    Подготовка объекта к изучению на трансмиссионном (просвечивающим) электронном микроскопе.
    Подготовка объекта к изучению на сканирующем (растровым) электронном микроскопе.
    Подготовка объекта к изучению под конфокальным лазерным сканирующим флуоресцентным микроскопом.
    Свойства фиксаторов.
    Свойства промежуточных жидкостей и сред, их функция и назначение.
    Особенности устройства световых и электронных микроскопов, их сравнительные характеристики.
    Луч света, луч лазера, электронный луч. В чём отличия, плюсы и минусы для биолога.
    Как нужно мыть посуду для приготовления маточных растворов?
    Свойства эпоксидных смол.
    Как приготовить эпоксидную смолу и как с ней работать?
    Что такое ультрамикротом? Шейкер? Найфмейкер?
    Для чего нужны бленды?
    "Контрастировать срезы" - это как?
    Зачем нужны пирамиды?
    Где используется установка для высушивания в критической точке?
    Зачем нам знать про тлеющий разряд? Что такое ионный напылитель?
    Понятие артефакта. Примеры артефактов в трансмиссионной, сканирующей и конфокальной микроскопии.
    Устройство конфокального сканирующего лазерного микроскпа; типы лазеров.
    Реакция антиген-антитело; методы визуализации иммунореакций.
    Как выбирать лазер для формирования изображения объекта?
    Чем отличаются изображения по осям x\y от x\z или y\z?
    Как формируется объёмное изображение на конфокальном микроскопе?

Рекомендованная литература:

Бисерова Н.М. 2013. Методы визуализации биологических ультраструктур. Подготовка биологических объектов для изучения с помощью электронных и конфокальных лазерных микроскопов. Практическое руководство для биологов. М.: Изд. КМК. 110 с.

Гайер Г. 1974. Электронная гистохимия. М.: "Мир". 488 с.

Луппа Х. 1980. Основы гистохимии. М.: "Мир". 343 с.

Ровенский Ю.А. 1979. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. М.: "Медицина". 151 с.

Уикли Б. 1975. Электронная микроскопия для начинающих. М.: "Мир". 324 с.

Bozzola J.J., Russell L.D. 1999. Electron Microscopy. 2nd Ed. Jones & Bartlett Pub. Inc. Sudbury. MA. 670p.

Maunsbach A.B., Afzelius B.A. 1999. Biomedical Electron Microscopy: illustrated methods and interpretation. Academic Press. USA. 548p.

Saper C.B., Sawchenko P.E. 2003. Magic peptides, magic antibodies: guidelines for appropriate controls for immunohistochemistry. The Journal of Comparative Neurology. 465:161–163.

Saper C.B. 2005. An open letter to our readers on the use of antibodies. The Journal of Comparative Neurology. 493:477–478.